活性氧（ROS）响应型前药、探针和诊疗一体化探针在ROS高表达相关疾病中的应用

4.1.2 溶酶体定位探针

4.1.3 核定位探针

4.2. 肿瘤细胞靶向探针

4.3 炎症细胞靶向探针

4.4 用于神经退行性疾病检测的探针

5、ROS响应诊疗一体化探针

6、总结

01

前言

活性氧（ROS）是具有化学活性的含氧分子，包括：过氧化氢（ H 2 O 2 ），超氧化物（ O 2 - ），超氧化物自由基阴离子（ O 2 •− ）和羟基自由基（ ·OH）。ROS是细胞氧代谢的天然副产物。在正常生理条件下，ROS与细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖等生命活动有关。异常情况下，细胞中的ROS水平升高。由于ROS的高活泼性，细胞产生氧化应激，导致功能障碍。这一病理变化与癌症、炎症、以及阿尔茨海默氏病（AD）和帕金森氏病（PD）等神经退行性疾病有关。

研究表明，细胞内的ROS水平主要与丙酮酸脱氢酶、NADPH氧化酶类（NOXs）、一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化酶等有关。正常状态下，细胞内的ROS含量大约在20 × 10 −3 μM。但是在与ROS相关的疾病状态下，ROS含量最高可达惊人的100 μM。因此，ROS也作为一种标志物或者靶向对象用于治疗、诊断ROS相关的疾病中。

近日，中国药科大学张晓进团队对ROS相关的前药、探针和诊疗一体化探针进行综述，发表在药物化学权威杂志 Journal of Medicinal Chemistry 上 。

02

ROS响应前药激活机制

图1 ROS响应团种类

ROS响应的前药或者探针大多由三部分组成： ROS响应部分、 药效部分以及 用于连接前两部分并且可以自发断裂的链。某些情况下，ROS响应器与药效部分直接相连的情况也是存在的。ROS响应部分大致分为以下四种：硼酸类（包括硼酸酯、硼酸）、羰基类（包括噻唑啉酮、芳基草酸酯）、含硫或硒类以及脯氨酸低聚物类。

以下图硼酸酯类ROS响应器Type A为例：

图2 苯硼酸酯ROS响应机制

如上图所示，含羟基、氨基的药物被甲基苯硼酸酯封闭成前药，富电子的过氧化氢进攻缺电子的硼酸酯，释放出对苯醌甲基化物( p -QM)，自断裂基团甲基苯氧基分解，前药水解成药物原型。

03

ROS响应前药

3.1 ROS响应抗肿瘤前药

由于本部分设计较多案例，故选取典型案例说明。

举例一

图 3 前药 5-8 结构与机制

氮芥是一种经典的抗肿瘤药物。氮芥进入体内后，通过分子内成环作用，形成高度活泼的乙烯亚胺离子，在中性或弱碱条件下迅速与多种大分子的亲核基团(如蛋白质的羧基、氨基、巯基、核酸的氨基和羟基、磷酸根)结合，进行烷基化作用，致使肿瘤细胞死亡。由于对肿瘤细胞没有选择性，该类药物具有较高的毒性。研究人员采用硼酸酯、硼酸将氮芥类药物设计成ROS响应前药5、6、8，当进入高浓度的过氧化氢环境后，原型药物释放出来。活性研究表明，在相同的细胞条件下，前药5和6不会引起正常淋巴细胞的凋亡，这表明前药具有良好的安全性。释放出原型药物之后，则释放出高毒性的原型药物。

举例二

图 4 前药 18 结构与机制

通过诱导细胞内ROS大量产生，达到稳态失衡，从而耗竭胞内还原性GSH是一种新兴的肿瘤治疗策略。5,8-二羟基-1,4-萘醌，又称萘茜是一种天然的抗肿瘤物质。萘茜能够自发地鳌合二价铜离子，消耗胞内的还原性GSH，同时将二价铜还原成一价铜，引起胞内ROS增多，GSH下降，氧化还原稳态失衡。但是萘茜本身对肿瘤细胞并没有靶向性，因此有研究人员将萘茜改造成带有双硼酯及自断裂链的前药，该前药可以靶向ROS高表达的环境，并释放出原型药萘茜。原型药物进一步地加重肿瘤细胞内ROS的产生，起到加重细胞负担，杀死肿瘤细胞的效果。

举例三

图 5 前药 20结构与机制

与例二类似，研究人员也设计一种基于二茂铁的前药。前药在过氧化氢高表达的环境下水解成原型药。而生成的苯醌甲基化物( p -QM)则可以与肿瘤细胞内的还原性GSH结合，通过进一步消耗肿瘤细胞的抗氧化系统，起到协同抗肿瘤活性。

3.2 ROS响应抗炎前药

炎症反应指的是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症反应常常伴随着体内氧化与抗氧化作用失衡，中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，即氧化应激的产生。反之，氧化应激的发生也是炎症反应发展的一大原因。炎症状态下，过氧化氢等活性氧的产生最高可达正常组织的100倍以上。鉴于ROS是炎症反应的一大特征，研究人员在针对炎症组织的ROS响应前药方面做了大量的工作。

图 6 ROS响应MTX前药33-35

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性的全身性炎症性疾病，可导致严重的关节损伤和其他关节外病变。小剂量甲氨蝶呤（MTX）是 RA 治疗中最主要和标准性的用药。除了治疗RA外，MTX作为一种抗代谢类抗肿瘤药，不可避免的具有一些副作用。研究人员根据MTX的结构设计了多种ROS响应的前药33、34、35。实验表明，这些前药在血液(pH = 7.4)、模拟胃液(SGF)酸性条件下、模拟肠液(SIF)碱性条件下以及肝微粒体中均表现出可接受的化学和代谢稳定性。在小鼠模型实验中，未发现明显的副作用以及体重减轻。因此，ROS响应的前药降低关节炎药物副作用。

图 7 ROS响应抗炎前药36-40

除了RA以外，炎症反应中基质金属蛋白酶（MMP）高表达，研究人员根据MMP抑制剂1,2-HOPO-2 、PY-2设计了前药36，37；根据炎症反应中Keak1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制剂设计了前药38；根据缺血再灌注（IR）中ROS的升高以及ATF6关键蛋白，设计了前药39，40；前药40表现出对肝、心I/R损伤明显的保护作用。

04

ROS响应探针

4.1 靶向ROS高表达环境荧光探针

图8 探针41-45 结构与机制

荧光探针是一类由荧光团、触发器以及linker组成的小分子化学工具，在化学生物学领域的研究中起到了重要的作用。研究人员根据荧光素、吩噁嗪、二苯并吡喃酮、罗丹明等荧光团设计了探针41-45，对ROS高表达环境进行荧光检测。

4.2 亚细胞定位探针

4.2.1 线粒体定位探针

线粒体是细胞呼吸的主要部位，也是活性氧的主要产生部位。线粒体中H 2 O 2 的产生对细胞的生存、生长和分化至关重要，细胞中H 2 O 2 的水平与包括癌症在内的多种疾病的发生发展密切相关。

ROS响应的线粒体定位探针通常由定位基团、荧光基团以及ROS触发基团三部分组成。研究人员根据线粒体膜带有负电荷（-180 mV）的性质，设计了如三苯基膦盐等带正电荷的基团用于开发线粒体靶向探针。

举例说明：

图9 探针52结构与机制

研究人员设计了一种线粒体定位探针52，该探针采用DABCYL基团作为罗丹明荧光团的淬灭基团，采用甲基苯硼酸酯作为ROS响应器，正电荷定位基团TPP作为线粒体定位的基团，该探针能够灵敏的检测线粒体的过氧化氢。

4.2.2 溶酶体定位探针

溶酶体是细胞内酸性的单膜囊状细胞器(pH值4.5 ~ 5.0)，负责细胞成分的循环和降解。ROS水平升高引起的溶酶体破坏可导致大量过氧化物蛋白和脂质蓄积在溶酶体中，这一病理变化与癌症、衰老相关的神经退行性疾病发生、发展过程有关。溶酶体定位的ROS检测探针设计对于理解相关疾病机制具有重要意义。

由于溶酶体比其他亚细胞器酸性更强，所以研究人员采用碱性的吗啉环作为溶酶体的定位基团，使探针在溶酶体内积累。

举例说明：

图10 探针54结构与机制

研究人员采用“定位基团-荧光团-linker-响应团”的模式设计了一种溶酶体定位的探针，这种探针本身没有荧光，积累在溶酶体后，溶酶体内的过氧化氢使探针恢复荧光团的荧光。

4.2.3 核定位探针

细胞核包含细胞的大部分遗传物质，ROS水平对核功能和基因转录具有重要影响。已经有证据显示，过量的ROS能够引起癌症细胞中DNA氧化修饰。因此设计核定位的ROS探针具有重要意义。

举例说明：

图11 探针57结构与机制

研究人员设计了一种带有SNG标签的荧光探针，这种标签能够通过Cys亲核取代而共价结合在目标蛋白上。研究人员利用这种探针靶向细胞核的H2B蛋白，从而能够特异性的对细胞核ROS作出效应。

4.3. 肿瘤细胞靶向探针

图12 探针62结构与机制

4.4. 炎症细胞靶向探针

图13 探针63结构与机制

4.5. 靶向神经退行性疾病探针

图14 探针64结构

大量证据表明，负责认知和记忆的大脑区域中的淀粉样β蛋白（Aβ）可被视为阿尔兹海默症（AD）最早症状的生物学标记。研究人员根据姜黄素（一种能够与Aβ结合的化合物）设计了ROS响应的、能够透过血脑屏障的探针64。该探针可用于AD模型大鼠的过氧化氢动态监测。

05

ROS响应诊疗一体化药物

诊疗药物，顾名思义，是一种结合了“治疗”和“诊断”功能的化合物。诊疗前药能够在诊断早期疾病的同时，将治疗药物传递到病变部位，监测药物释放，并可视化疾病发展阶段。这种一步到位的方法可以为病人提供准确、有效和快速的诊断、治疗。

举例说明一：

图15 诊疗药物66结构与机制

研究人员设计了一种包含四个部分的诊疗探针：第一部分是生物素用于癌症靶向，可将探针引导至肿瘤组织；第二部分是靶向线粒体的荧光报告基因菲啶，它在水环境中无光或发微弱光，一旦与双链DNA或RNA相互作用后，它会发出强烈的荧光；第三部分是无活性的5'-脱氧-5-氟尿嘧啶（5'-DFUR），在癌细胞高表达的胸苷磷酸化酶催化水解后会转化为活性形式5-氟尿嘧啶（5-FU）。第四部分是ROS响应的苯基硼酯响应基团。这一诊疗药物不仅能够选择性地分布于肿瘤组织，肿瘤荧光强度约为其他正常组织(包括肺、肝、心、肾、脾)的7倍，而且还能够发挥优异的抗肿瘤作用。

举例说明二：

图16 光动力诊疗药物71结构与机制

光动力疗法(PDT)是用光敏药物和激光活化治疗肿瘤疾病的一种新方法。用特定波长照射肿瘤部位，能使选择性聚集在肿瘤组织的光敏药物活化，引发光化学反应破坏肿瘤。研究人员设计了一种自发的纳米复合诊疗系统，前体药物CPPO遇到过量的过氧化氢后，生成小分子DOTD，该小分子再经过自发聚合原位生成光敏剂TPP，发挥光动力治疗的作用。

本综述为设计ROS相关的荧光探针、前药以及诊疗探针提供思路，也为氧化应激相关的课题研究提供参考工具。

Reactive Oxygen Species (ROS)-Responsive Prodrugs, Probes, and

Theranostic Prodrugs: Applications in the ROS-Related Diseases. Pengfei Wang, Qijie Gong, Jiabao Hu, Xiang Li,* and Xiaojin Zhang*. J. Med. Chem . 2021, 64, 298−325

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